IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozidas) yra β-galaktozidazės substrato analogas, kuris yra labai indukuojamas.Indukuojant IPTG, induktorius gali sudaryti kompleksą su represoriaus baltymu , todėl represoriaus baltymo konformacija pasikeičia taip, kad jo negalima sujungti su tiksliniu genu, o tikslinis genas ekspresuojamas efektyviai.Taigi, kaip eksperimento metu turėtų būti nustatyta IPTG koncentracija?Ar kuo didesnis tuo geriau?
Pirma, supraskime IPTG indukcijos principą: E. coli laktozės operone (elemente) yra trys struktūriniai genai Z,Y ir A, kurie atitinkamai koduoja β-galaktozidazę, permeazę ir acetiltransferazę.lacZ hidrolizuoja laktozę į gliukozę ir galaktozę arba į alolaktozę;lacY leidžia aplinkoje esančiai laktozei prasiskverbti pro ląstelės membraną ir patekti į ląstelę;lacA perkelia acetilo grupę iš acetil-CoA į β-galaktozidą, o tai pašalina toksinį poveikį.Be to, yra veikianti seka O, pradinė seka P ir reguliacinis genas I. I geno kodas yra represoriaus baltymas, galintis prisijungti prie operatoriaus sekos padėties O, todėl operonas (meta) yra represuojamas ir išjungė.Taip pat yra katabolinio geno aktyvatoriaus baltymo ir CAP surišimo vietos surišimo vieta prieš inicijuojančios sekos P seką. P seka, O seka ir CAP surišimo vieta kartu sudaro lac operono reguliavimo sritį.Trijų fermentų koduojančius genus reguliuoja ta pati reguliavimo sritis, kad būtų pasiekta suderinta genų produktų ekspresija.
Trūkstant laktozės, lako operonas (meta) yra represijos būsenoje.Šiuo metu lac represorius, išreikštas I sekos, kontroliuojamas PI promotoriaus sekos, prisijungia prie O sekos, kuri neleidžia RNR polimerazei prisijungti prie P sekos ir slopina transkripcijos inicijavimą;kai yra laktozės, gali būti sukeltas lac operonas (meta) Šioje operono (meta) sistemoje tikrasis induktorius nėra pati laktozė.Laktozė patenka į ląstelę ir yra katalizuojama β-galaktozidazės, kuri paverčiama alolaktoze.Pastaroji, kaip induktoriaus molekulė, jungiasi prie represoriaus baltymo ir keičia baltymo konformaciją, o tai lemia represoriaus baltymo atsiribojimą nuo O sekos ir transkripcijos.Izopropiltiogalaktozidas (IPTG) turi tokį patį poveikį kaip ir alolaktozė.Tai labai galingas induktorius, kurio nemetabolizuoja bakterijos ir yra labai stabilus, todėl plačiai naudojamas laboratorijose.
Kaip nustatyti optimalią IPTG koncentraciją?Paimkite E. coli kaip pavyzdį.
E. coli BL21 genetiškai modifikuota padermė, turinti teigiamą rekombinantinį pGEX (CGRP/msCT), buvo pasėta į skystą LB terpę, kurioje yra 50 μg·mL-1 Amp, ir kultivuojama per naktį 37 °C temperatūroje.Aukščiau minėta kultūra buvo pasėta į 10 butelių 50 ml šviežios LB skystos terpės, kurioje yra 50 μg·mL-1 Amp, santykiu 1:100 plėtrai, ir kai OD600 vertė buvo 0,6–0,8, IPTG buvo pridėta iki galutinės koncentracijos.Tai yra 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol · L-1.Po indukcijos toje pačioje temperatūroje ir tuo pačiu metu iš jo buvo paimtas 1 ml bakterijų tirpalo, o bakterijų ląstelės surenkamos centrifuguojant ir tiriamos SDS-PAGE, siekiant išanalizuoti skirtingų IPTG koncentracijų įtaką baltymų ekspresijai. pasirinkite IPTG koncentraciją su didžiausia baltymų ekspresija.
Po eksperimentų bus nustatyta, kad IPTG koncentracija nėra tokia didelė, kaip įmanoma.Taip yra todėl, kad IPTG turi tam tikrą toksiškumą bakterijoms.Koncentracijos viršijimas taip pat sunaikins ląstelę;ir apskritai kalbant, tikimės, kad kuo tirpesnis baltymas ekspresuojamas ląstelėje, tuo geriau, tačiau daugeliu atvejų, kai IPTG koncentracija yra per didelė, susidarys didelis inkliuzų kiekis.Kūno, bet sumažėjo tirpių baltymų kiekis.Todėl tinkamiausia IPTG koncentracija dažnai būna ne kuo didesnė, tuo geriau, bet kuo mažesnė.
Genetiškai modifikuotų padermių indukcijos ir auginimo tikslas – padidinti tikslinio baltymo derlių ir sumažinti išlaidas.Tikslinio geno ekspresiją veikia ne tik padermės faktoriai ir ekspresijos plazmidė, bet ir kitos išorinės sąlygos, tokios kaip induktoriaus koncentracija, indukcijos temperatūra ir indukcijos laikas.Todėl apskritai, prieš ekspresuojant ir išgryninant nežinomą baltymą, geriausia ištirti indukcijos laiką, temperatūrą ir IPTG koncentraciją, kad būtų parinktos tinkamos sąlygos ir gauti geriausi eksperimentiniai rezultatai.
Paskelbimo laikas: 2021-12-31